Diagnóstico por laboratorio

Para identificar la infección por Cryptococcus el médico debe indagar sobre signos y síntomas y los factores de riesgo del paciente. Según los órganos posiblemente comprometidos se deberán enviar todas las muestras posibles para descartar si hay diseminación del agente. Las muestras clínicas más comúnmente remitidas al laboratorio para el diagnóstico de criptococosis incluyen: líquido cefalorraquídeo, sangre, esputo, lavado broncoalveolar, orina, material purulento, biopsias u otros líquidos, y la escarificación de las lesiones cuando las lesiones son en piel o mucosas. Estas muestras serán procesadas de acuerdo a su tipo para la realización de exámenes directos, coloraciones histopatológicas, cultivos y pruebas adicionales. También es posible la obtención de LCR o suero para la realización de técnicas de inmunodiagnóstico.

Examen directo e histopatología (microscopía)

Los exámenes directos ofrecen resultados rápidos para que el médico pueda tomar decisiones más acertadas al momento de iniciar la terapia antimicótica. A partir de las muestras líquidas se puede realizar el examen directo en fresco entre lámina y laminilla y en todas las muestras, el KOH, ambos para ser observados en los objetivos de 10X y 40X. La morfología de las blastoconidias no es exclusiva para Cryptococcus y en estos montajes directos no es posible observar la capsula, por tanto, no se podría especificar el género del hongo. Para evidenciar la presencia de cápsula y poder informar al médico que las blastoconidias corresponden a Cryptococcus spp. deben realizarse los directos con tinta china, nigrosina o azul de metileno (este colorante se utiliza para muestras como material purulento o leche donde la tinta china y la nigrosina se flocula). En la coloración de Gram también es posible la observación de las blastoconidias, además es posible que la cápsula se insinúe.

Los cortes histopatológicos pueden ser coloreados con hematoxilina eosina, plata metenamina de Grocott-Gomori y ácido peryódico de Schiff (PAS) para observar la respuesta tisular en los objetivos de 40 X y 100X (no en la PM), sin embargo, estas coloraciones, a excepción de la PM, tiñen poco las estructuras del hongo y no evidencia claramente la cápsula, la cual se sugiere como un espacio vacío alrededor de las blastoconidias. Las coloraciones de Mucicarmina de Meyer y azul de alciano permiten la tinción de la capsula facilitando la identificación de las estructuras a nivel de género.

Cultivos

Esta levadura crece muy bien en medios libres de actidiona como el agar Sabouraud y el agar PDA, también en medios bacteriológicos como el agar sangre, el agar chocolate y el BHI en un periodo de tiempo de 48 a 72 horas a temperaturas entre 25 a 35 ºC. En estos medios se da la formación de colonias cremosas o mucoides (aislamientos con abundante cápsula), de color crema o café claro. Para la recuperación e identificación rápida de Cryptococcus spp. se recomienda el uso de medios ricos en compuestos fenólicos como agar semilla (girasol, guisotea, alpiste, níger), ácido cafeico, paprika o rábanos, en los cuales las colonias de este género producen pigmentos café oscuro por la abundante producción de melanina, lo que facilita su diferenciación de las colonias de Candida spp. cuyas colonias permanecen blancas o crema. Cuando no se dispone de medio con compuestos fenólicos, la diferenciación de las colonias de Cryptococcus spp. de otras levaduras como Candida spp., puede hacerse con un montaje con tinta china para observar la cápsula o mediante la prueba de la urea a 25 °C en el cuál Cryptococcus spp. al ser ureasa positiva daría la prueba positiva mientras Candida no viraría el color del medio. Para la identificación a nivel de complejo de especies se puede utilizar la prueba de la urea incubada a 37 °C, temperatura en la cual las especies del complejo C. neoformans pierde su actividad ureasa y da la prueba negativa, mientras que los del complejo C. gattii la retiene y da la prueba positiva. También se puede emplear el medio CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol) en el cual las especies del complejo gattii al resistir a la acción antifúngica de la canavanina y crecer utilizando la glicina como fuente de carbono y nitrógeno liberan amoniaco que alcaliniza el medio de cultivo tornándolo de un color azul, mientras que las especies del complejo neoformans son incapaces de cambiar el color del medio permaneciendo de color verde. La identificación más fidedigna a nivel de especie molecular se lograría empleando las técnicas de PCR de las que se hablará más adelante.

Inmunodiagnóstico

Comercialmente hay disponibles tres métodos para la detección de antígenos de Cryptococcus, que se pueden realizar a partir de muestras como líquido cefalorraquídeo, suero, plasma y sangre total, siendo ampliamente utilizado en el diagnóstico rápido en pacientes VIH positivos muy inmunosuprimidos. Las plataformas disponibles son la de aglutinación con partículas de látex que detecta el antígeno capsular de Cryptococcus spp. empleando partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos contra el hongo, el inmunoensayo enzimático (EIA) no distribuidos ampliamente, y el ensayo de flujo lateral (LFA), el cual por su fácil y rápida realización y bajos costos es la técnica más utilizada. Estas pruebas pueden ser cuantitativas por lo que pueden ser empleadas para el seguimiento de los pacientes, no obstante, recientemente los grupos que han diseñado las guías consenso para el diagnóstico, tratamiento y vigilancia de los pacientes con criptococosis descartan el uso de estas pruebas de inmunodiagnóstico para el seguimiento de la respuesta a la terapia, debido a que no se observa correlación entre la mejoría de los síntomas y los títulos de antígeno, por tal razón proponen el cultivo cuantitativo como único método para hacer este seguimiento.

Pruebas moleculares

Las técnicas de biología molecular pueden ser empleadas para la búsqueda directa del material genético del hongo en las muestras de los pacientes o para obtener la identificación a nivel de especie una vez el hongo sea recuperado del cultivo. En el mercado se cuenta con el panel de PCR BioFire FilmArray Meningitis/Encephalitis (Biofire Diagnostics, Salt Lake City, UT) aprobado por el FDA en el 2016 que consiste en una PCR múltiple para 14 blancos los cuales incluyen bacterias, virus y levaduras del complejo C. neoformans y C. gattii.

Para la identificación de especies a partir de los aislamientos se han empleado diversas técnicas moleculares. Inicialmente se utilizaron los métodos de hibridación ADN-ADN y electrocariotipificación. Más recientemente se han aplicado técnicas de identificación basadas en PCR (anidada, multiplex, en tiempo real) y de tipificación como PCR fingerprinting, RAPD, PCR–RFLP, AFLP y MLST.

Galeria Criptococosis